實(shí)時(shí)熒光PCR(real time PCR)是目前應(yīng)用最廣的核酸檢測(cè)技術(shù)，檢測(cè)模式采用閉管檢測(cè)，相對(duì)于開(kāi)管檢測(cè)而言，real time PCR極大降低了擴(kuò)增產(chǎn)物的污染機(jī)會(huì)，節(jié)省了時(shí)間和人力，便于實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化，更可以利用閾循環(huán)數(shù)（Cq值）支持定量檢測(cè)。

然而，real time PCR的一個(gè)很大局限在于單個(gè)反應(yīng)所能檢測(cè)的靶基因數(shù)目有限。

根據(jù)目前主流熒光PCR儀器檢測(cè)通道數(shù)目，單個(gè)反應(yīng)所能檢測(cè)的靶基因數(shù)目很難超過(guò)4-6個(gè)，限制了該技術(shù)在涉及多靶點(diǎn)的復(fù)雜疾病上的應(yīng)用。

在PCR反應(yīng)后添加熔解分析步驟，可在一定程度上增加可檢測(cè)靶基因數(shù)目，但是，伴隨熒光探針類型的增加，熒光背景及檢測(cè)成本也隨之升高，尤其是，探針結(jié)合區(qū)任何核酸變異都可能引起熔點(diǎn)偏移，導(dǎo)致結(jié)果誤判，使得該法對(duì)于靶標(biāo)數(shù)目的提升依然受限。

與那些廣受矚目的高通量檢測(cè)技術(shù)相比，已有30年歷史的real time PCR似乎正成為一種“低階”核酸檢測(cè)技術(shù)。

在2022年2月24日在線發(fā)表于《美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊》（PNAS）的一項(xiàng)研究中，廈門大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院李慶閣團(tuán)隊(duì)報(bào)道了一種稱為“MeltArray”的熒光PCR新技術(shù)，一舉將熒光PCR的單管檢測(cè)能力提高到一個(gè)數(shù)量級(jí)以上，并通過(guò)多個(gè)臨床應(yīng)用場(chǎng)景，系統(tǒng)展示了該技術(shù)強(qiáng)大而靈活的檢測(cè)能力。

"MeltArray"巧妙地利用了TaqDNA聚合酶的5'-瓣?duì)顑?nèi)切酶活性，在PCR反應(yīng)中，該活性將位于引物下游的“媒介探針”切割，生成“媒介引物”，“媒介引物”進(jìn)而與分子信標(biāo)報(bào)告探針結(jié)合，在Taq酶聚合活性作用下，沿著分子信標(biāo)延伸生成具有特定熔點(diǎn)的熒光雙鏈，最終使媒介探針特異識(shí)別的靶標(biāo)獲得一個(gè)包括熒光類型和熔點(diǎn)值的“二維”標(biāo)記。

由于每個(gè)分子信標(biāo)可以允許多個(gè)媒介引物形成一系列具有不同熔點(diǎn)的熒光雙鏈，單個(gè)MeltArray多重?zé)晒釶CR反應(yīng)可檢測(cè)的總靶基因數(shù)目就等于反應(yīng)中分子信標(biāo)數(shù)目乘以其所容納的媒介引物數(shù)目。作者在文中展示了單個(gè)熒光通道可檢測(cè)12個(gè)靶標(biāo)，6個(gè)熒光通道的儀器可以檢測(cè)多達(dá)72個(gè)靶標(biāo)！這是單個(gè)閉管PCR一步法迄今所能檢測(cè)的最大靶基因數(shù)目。

該技術(shù)實(shí)現(xiàn)的關(guān)鍵是獲取一種具有“多泊位”的報(bào)告探針，以容納眾多的媒介引物。研究人員首先比較了線性探針和分子信標(biāo)分別用作報(bào)告探針的優(yōu)劣，分子信標(biāo)因具有清晰的背景而勝出。接著，作者考察了分子信標(biāo)的“多泊位”能力。他們小心翼翼地從兩重PCR開(kāi)始，首先證明一個(gè)分子信標(biāo)可以允許兩個(gè)“媒介引物”停泊；又通過(guò)一個(gè)四重PCR，證明了一個(gè)分子信標(biāo)可以允許四個(gè)“媒介引物”疊加式停泊，由此，提出了一個(gè)分子信標(biāo)可以容納任意多個(gè)媒介引物的假設(shè)。根據(jù)目前熒光PCR儀器的熔點(diǎn)分辨率，利用兩個(gè)分子信標(biāo)，實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了單個(gè)熒光通道即可檢測(cè)12個(gè)靶基因。最后研究人員構(gòu)建了一個(gè)陣列式結(jié)構(gòu)的“媒介子”庫(kù)及其對(duì)應(yīng)的分子信標(biāo)報(bào)告探針，以實(shí)現(xiàn)檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)化。

為降低多重PCR中多對(duì)引物并存可能產(chǎn)生的引物二聚體干擾，研究人員又引入了“PCR抑制”概念，至此提出了MeltArray的完整技術(shù)原理（圖1）。

為驗(yàn)證MeltArray的多重檢測(cè)能力，作者首先設(shè)計(jì)了一個(gè)20重PCR的MelArray檢測(cè)體系，覆蓋人類Y染色體無(wú)精子因子區(qū)域(AZFa、AZFb、AZFc和AZFd)的18個(gè)序列標(biāo)簽位點(diǎn)和2個(gè)參照基因（SRY基因和ZFX/Y基因）。在正常男性樣本，20個(gè)位點(diǎn)全部存在，即均有熔解峰，而患者男性則會(huì)出現(xiàn)1個(gè)或多個(gè)熔解峰的缺失——該實(shí)驗(yàn)是一個(gè)典型的多靶標(biāo)同時(shí)出現(xiàn)的例子（圖2）。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該MelArray體系僅利用三個(gè)熒光通道，就實(shí)現(xiàn)了20個(gè)靶標(biāo)的同時(shí)檢出。為評(píng)估模板量對(duì)MeltArray檢測(cè)能力的影響，作者考察了從100ng到100pg的健康男性和女性的基因組DNA，在該范圍內(nèi)，所有模板均被穩(wěn)定檢出。隨著DNA模板量的逐漸降低，熔解峰高度有所下降，但20個(gè)峰的熔點(diǎn)值均未發(fā)生變化。最后，作者通過(guò)對(duì)757份樣本的雙盲檢測(cè)，證實(shí)了MeltArray體系的準(zhǔn)確性。

圖2? ?MeltArray技術(shù)應(yīng)用于20重人類Y染色體微缺失的檢測(cè)

受以上結(jié)果鼓舞，作者開(kāi)始挑戰(zhàn)更多的靶標(biāo)數(shù)目。這次，他們使用六個(gè)熒光通道設(shè)計(jì)了一個(gè)62重PCR的MeltArray檢測(cè)體系（圖3），用于識(shí)別61種O抗原合成基因及1個(gè)大腸桿菌管家基因yccT。我們看一下此時(shí)每個(gè)通道的檢測(cè)數(shù)目，按照熒光波長(zhǎng)從低到高的次序，六個(gè)熒光通道檢測(cè)的靶標(biāo)數(shù)目分別是11、9、12、12、8和10個(gè)！各個(gè)通道的重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用3倍標(biāo)準(zhǔn)偏差顯示，每一個(gè)靶標(biāo)對(duì)應(yīng)的熔點(diǎn)值均穩(wěn)定且能明確區(qū)分。最后，作者利用該體系鑒定了167株大腸桿菌培養(yǎng)株的血清型，除了覆蓋范圍之外的4株，檢測(cè)結(jié)果與全基因組測(cè)序結(jié)果完全一致，而且比傳統(tǒng)抗血清法多鑒定出11株，還另外糾正了其鑒定錯(cuò)誤的1株。

圖3? ?MeltArray技術(shù)用于61種大腸桿菌O血清型分型

上述兩個(gè)例子均為定性檢測(cè)，那么，MeltArray可否另外進(jìn)行定量檢測(cè)呢？為回答這一問(wèn)題，研究團(tuán)隊(duì)設(shè)計(jì)了一個(gè)24重PCR的呼吸道病原體檢測(cè)體系（圖4），他們將其中的19種非定植菌/病毒和1個(gè)內(nèi)控基因設(shè)置為熔解分析模式，即定性檢測(cè)；另外4種細(xì)菌設(shè)置為實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)模式——即TaqMan探針模式，即定量檢測(cè)。

需要指出的是，作者選擇變性階段進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)。他們相信，實(shí)時(shí)檢測(cè)的對(duì)象是探針酶切后積累的熒光信號(hào)，無(wú)論變性階段還是延伸階段，檢測(cè)結(jié)果應(yīng)該一致。在變形階段，任何報(bào)告探針產(chǎn)生的熒光都會(huì)趨于一致，而不影響實(shí)時(shí)檢測(cè)結(jié)果。

事實(shí)證明了作者的這一設(shè)想。該體系在定性檢測(cè)19種靶基因的同時(shí)，成功實(shí)現(xiàn)了4種靶基因的定量檢測(cè)。24重PCR的MeltArray檢測(cè)體系分析靈敏度達(dá)10copies/μl。通過(guò)對(duì)67份肺炎或呼吸道感染患者的肺泡灌洗液樣本的驗(yàn)證，證實(shí)了檢測(cè)結(jié)果的可靠性。

圖4? 實(shí)時(shí)PCR和熔解曲線分析同時(shí)應(yīng)用于呼吸道病原體的定性和定量檢測(cè)

突變分析是核酸檢測(cè)另一重要醫(yī)療器械創(chuàng)新網(wǎng)，為考察MeltArray可否用于突變分析，研究團(tuán)隊(duì)以KRAS突變?yōu)槔?，設(shè)計(jì)了一個(gè)稱為“微測(cè)序”的突變鑒定體系，即在單個(gè)反應(yīng)管內(nèi)一一鑒定出發(fā)生在KRAS基因密碼子12和密碼子13上的9種類型的突變（圖5）。

在這里，作者利用了探針雜交的特異性，利用10條媒介探針，對(duì)上述9種突變類型和野生型分別加以二維標(biāo)記。實(shí)驗(yàn)表明，該體系具有極佳的突變檢測(cè)特異性，可耐受高達(dá)500ng的野生型基因組DNA，可檢測(cè)的突變等位基因頻率達(dá)到5%-10%，優(yōu)于Sanger測(cè)序——其最低突變等位基因頻率在10%-20%之間，檢測(cè)限低至30個(gè)拷貝每反應(yīng)。

最后作者利用該體系檢測(cè)了167份結(jié)直腸癌組織樣本的KRAS突變類型，獲得了與Cosmic數(shù)據(jù)庫(kù)一致的突變頻率分布，同時(shí)也表明，MeltArray比Sanger測(cè)序具有更靈敏的突變檢測(cè)能力。

圖5? MeltArray技術(shù)用于KRAS突變的微測(cè)序